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《Cell》：不切割 DNA 的 CRISPR 终于诞生！魔剪化身“基因开关”，有望攻克肾病、糖尿病等多种常见病

百家作者：DeepTech深科技 2017-12-14 09:45:52

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近年来，随着科学家们对基因编辑技术的不断探索，锌指核酸内切酶（ZFN）、TALEN 技术相继被发现并应用。而 CRISPR-Cas 系统一经发现，就因其简便的操作、精准的 DNA 靶向及剪切功能，被生物学家在分子合成和临床治疗中寄予厚望，甚至被认为可以带来整个生命科学领域的颠覆。

但对 DNA 进行剪辑，使其双链打开，就相当于将遗传信息的在毫无保护措施的情况下“门户大开”，无法预料的基因突变极有可能随机插入基因组中，同时由于脱靶效应，一旦 CRISPR-Cas 系统对错误的区域进行剪切或插入，极有可能诱发原癌基因的表达，最终导致癌症，造成不可逆转的伤害。

图 | CRISPR-Cas9 TGA 系统介绍

而今，来自美国索尔克研究所（Salk Institute）的研究人员对此取长补短另辟蹊径，他们对 CRISPR-Cas9 系统进行编辑，并只对其精准的基因定位功能加以利用，使其只靶向某些特定基因而不剪辑，激活沉默基因的表达而不破坏 DNA 的完整性，通过表观遗传修饰技术对生物的相关特性进行修正。

该研究首次将以表观遗传为靶向的 CRISPR-Cas9 系统应用于活体（小鼠）的沉默基因激活、遗传缺陷修正及细胞功能类型诱导分化上，针对小鼠的 I 型糖尿病、肾损伤及杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）均有显著治疗效果，相关的研究细节发表在 12 月 7 日的《细胞》杂志上。

“极有创造性，未来很可能产生广泛而深远的影响”，是来自美国斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）的著名遗传学家 Eric Topol 对该项目的评价，“未来该系统在特异性药物的研发上也具有极大的潜能。”

一般来说，CRISPR-Cas9 由 gRNA 和 Cas9 DNA 剪切酶这两个重要部分组成行使基因编辑的功能，gRNA 就像工程的指挥者，发现目标位置并指挥 Cas9 剪刀手对目的序列进行剪切。

“在使用 CRISPR-Cas9 系统对 DNA 进行编辑的问题上，如何避免有害的错误基因引入一直是该技术的瓶颈，”该项研究的通讯作者 Juan Carlos Izpisua Belmonte 介绍到，如果因修正旧的遗传错误而带来的新基因突变可以说是赶走了狼又迎来了虎。

聪明的科学家很快意识到，也许可以对这个系统的功能“择优”使用，纠正一个基因的错误，不一定非要“斩草除根”，“缴械”也是一个可行的思路。

图 | 在科学中乘风破浪的科学家

这项被称为 CRISPR-Cas9 TGA（target gene activation）的系统是基于 CRISPR-Cas9 系统的编辑，使 Cas9 失去剪切功能，只能对基因组的特定基因进行精准定位，通过募集某些转录组件（即分子开关），激活沉默基因的表达—— 基因魔剪至此“缴械”，成为一只划重点的“荧光笔”，调控特定基因的开关，从表观基因组上对生物性状进行影响。

一般的实验是使 Cas9 失活，该实验是使 gRNA 失活，相比修饰前的 gRNA（20-22 个核苷酸），失活的 gRNA 只有 14 个核苷酸的长度，失活的 gRNA 仍旧可以使 Cas9 定位在特定序列，但虽然 Cas9 仍有剪切功能，但并不对序列进行剪切。

表观遗传学（epigenetics），又称为外遗传学、后遗传学，在生物学和特定的遗传学领域，其研究的是在不改变 DNA 序列的前提下，通过某些机制引起基因表达或细胞表现型的变化。

那么说了这么多，试验效果如何呢？

该研究团队使用腺相关病毒（adeno-associated viruses , AAVs）作为载体，将编辑过的 dgRNA（失活的 gRNA）、转录激活因子（分子开关）分别注射入小鼠体内（试验中所使用小鼠已可表达 Cas9），随后 CRISPR-Cas9 TGA 系统将对特定区域进行识别，诱导靶向基因转录表达。使用该系统可以在不产生双链断裂及突变的情况下对表观遗传进行编辑，因而可以安全地用于不同基因及遗传通路的激活中。

接下来该团队从多种疾病上对该系统的功能进行活体验证，效果十分显著。在小鼠的急性肾炎治疗中，研究人员通过实验证明该技术可以激活之前受损基因或沉默的基因的表达，进而恢复正常的肾功能。

对于患有 I 型糖尿病的患者，负责产生胰岛素的胰腺β细胞遭到自身免疫反应破坏，因而胰腺无法再次分泌胰岛素抑制血糖。研究者试图从其他地方“借”来细胞工厂生产胰岛素，所以他们尝试对部分肝细胞进行诱导，使用失活的 dgRNA 募集分子开关激活 Pdx 的表达，使其分化成为类胰岛素细胞—即可以合成胰岛素，一定程度缓解了小鼠的 I 型糖尿病症状。

“十余年来，很多实验室都在尝试改变细胞的功能类型”，来自宾夕法尼亚佩雷尔曼医学院的临床科学家 Kirk Wangensteen 说到，对于科学家理解究竟是什么因素决定了细胞的身份来说，该研究意义非凡。

图 | 接受过治疗小鼠的肌肉纤维（右）明显大于对照组（左）

同时该研究团队也在模拟杜氏肌营养不良的肌肉萎缩小鼠身上测试了他们的系统。杜氏肌营养不良是由于肌萎缩蛋白基因突变导致的，由于其该基因太大，病毒无法装载，因而传统的基因疗法对于该疾病无计可施。但研究者发现，通过激活该通路的另一基因 follistatin 同样可以达到增加肌肉的效果，在该项研究中，接受该系统治疗的小鼠肌肉量要明显高于对照组。

“我们并没有修复基因，这个突变仍旧是存在的”，Belmonte 说到，“相反，我们从表观遗传入手，使小鼠恢复同一通路中其他基因的表达，这些就足以让患有肌肉功能障碍的小鼠恢复正常。”

使用 CRISPR 系统来编辑表观基因组，这个先河并非由索尔克研究所的科学家们所开，但他们首次在活体上验证了该系统的安全性和可行性。尽管从小鼠到人类仍有很远的路，但这一步实验的成功，无疑是至关重要的一步。